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[技术] | 魏春华#黄夏玲#杨 圆#何 乐#林志锋#徐 叶#黄文琳#柳开隆#戴爱玲#杨小燕#刘建奎 | 《1.龙岩学院 生命科学学院;2.福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室;3.预防兽医学与生物技术福建省高校重点实验室;4.福建农林大学 动物科技学院》 | 2023-02-28 | 浏览:190
摘要: 【目的】利用DNA改组技术(DNA shuffling)对不同谱系的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因进行体外重组,构建具有良好交叉保护作用的 DNA疫苗,为研制新型 PRRSV疫苗提供参考。【方法】利用DNA改组技术对 PRRSV谱系1,3,5.1,8.7毒株的ORF5基因进行体外突变重组,筛选去除信号肽的重组突变体。将重组突变体与真核表达载体pCAGGS-HA 连接,构建重组表达质粒并进行酶切和测序鉴定,经脂质体转染MARC-145细胞,利用间接免疫荧光试验(IFA)和Western blotting试验检测目的蛋白的表达情况。将重组质粒pCA-△ORF5-8和 pCA-△ORF5-46(ORF5基因重组的 DNA疫苗)免疫小鼠﹐试验同时设pCAGGS-HA空载体组、PBS空白对照组,弱毒疫苗组(经典弱毒疫苗Ingelvac PRRS MLV,MLV组)和 pCA-ORF5-MLV组(ORF5基因来自IngelvacPRRS MLV),评估其免疫效果。【结果】筛选到2个去除信号肽的重组突变体(△ORF5-8和△ORF5-46)。成功构建重组表达质粒pCA-△ORF5-8和pCA-△ORF5-46,其可在MARC-145细胞中表达GP5蛋白。与 pCAGGS-HA空载体组和PBS空白对照组相比,pCA-△ORF5-8和 pCA-△ORF5-46组免疫小鼠血清白介素4(IL-4)和干扰素y(INF-y)含量均极显著提高(P<0.01) ,脾淋巴细胞增殖能力均极显著增强(P<0.01),均能产生针对GP5蛋白的抗体,血清中和试验表明,免疫组小鼠血清能对异源毒株产生交叉中和抗体(抗体平均滴度为10~16)。【结论】重组DNA疫苗pCA-△ORF5-8和 pCA-△ORF5-46均能有效刺激并诱导机体产生细胞及体液免疫应答,具有良好的免疫原性。